环境微生物群落多样性分析【11664858.com转】

2019-05-03 12:16 来源:未知

这是科学家们第一次尝试追踪微生物如何从我们的身体上来到房间,以及它们如何由房间转移到我们身体上来。“我们已经得知,有些微生物会让我们增重,有些则会影响我们神经系统的发育,而我们则试图了解这些微生物在家庭中的来龙去脉。”芝加哥大学的杰克•吉尔伯特(Jack Gilbert )如是说。吉尔伯特是这项研究的领导者,研究结果于近日发表在《科学》杂志上。

**研究方法进展
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环境微生物多样性的研究方法很多,从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类:传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。
近几年,随着分子生物学的发展,尤其是高通量测序技术的研发及应用,为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。
目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术,在其实验结果中往往只含有数十条条带,只能反映出样品中少数优势菌的信息;另一方面,由于分辨率的误差,部分电泳条带中可能包含不只一种16S rDNA序列,因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息,还需对每一条带构建克隆文库,并筛选克隆进行测序,此实验操作相对繁琐;此外,采用这种方法无法对样品中的微生物做到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息,“只能验证已知,却无法探索未知”,此方法通过信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的准确。
而近年来以454焦磷酸测序为代表的高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台。Roche 454高通量测序技术能同时对样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种进行检测,获得样品中的微生物群落组成,并将其含量进行数字化。最近,美吉生物推出了新的测序平台———MiSeq。MiSeq高通量测序平台集中了Roche 454和Illumina HiSeq 2500的优点,不仅可实现对多样品的多个可变区同时测序,而且在测序速度和测序通量上都有进一步提升,目前此平台已在微生物多样性群落结构研究方面受到了广大学者的认可。

也许下次搬家的时候,你会把牙刷什么的抛在脑后,不过有一样东西你一定会“随身携带”:微生物。数以百万的微生物搭着你的“顺风车”四处移动,轻松自如,毫不费力。不同的人,会携带有不同个人特征的微生物菌群,而在你入住到一个新的房屋内几个小时之后,它们就将“殖民”到房间里,并会在24小时内“宣布”:这个房间被我们承包了。而以上,仅仅是“家庭微生物群落研究”结果内的很小一部分。

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微生物:看不见的“入侵者”,超酷的“盟友”。图片来源:sgugenetics.pbworks.com

高通量测序:环境微生物群落多样性分析

文章题图:www.plaqpro.com.au

产品优势
无需培养分离菌群:
直接从环境样本中扩增核糖体RNA 高变区进行测序,解决了大部分菌株不可培养的难题。
客观还原菌群结构:
专业、成熟、稳定的样本制备流程,严格控制PCR 循环数,客观还原样品本身的菌群结构及丰度比例。
痕量菌检测:
充分发挥高通量测序的大数据量优势,能检测出丰度低至万分之一的痕量菌。

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高通量测序:环境微生物群落多样性分析

微生物“签名”意味着啥?

我们携带的微生物数量是多少呢?大概有我们自己的全身细胞数量的十分之一。每当我们呼吸、打喷嚏或者咳嗽时,我们都会留下这些微生物的“痕迹”。同样,通过接触或者间接接触,其他人也会将他们的微生物留在房间内,并传递到我们身上。而根据我们在房屋内停留时间的长短,我们携带的微生物在房屋内留下“痕迹”也会有一些差别。尽管如此,我们仍然对这些留在房间内的以及我们身体上的“小东西”之间的关系一无所知。

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人体和周围的微生物"签名"示意图。图片来源:研究论文

针对以上的问题,吉尔伯特和他的同事们开始了他们的“家庭微生物群落”研究。研究人员绘制了七个家庭的微生物特征,其中的三个家庭在实验途中会搬到别处。这些家庭来自美国各地,拥有不同的社会、经济以及种族背景。六周后,研究人员再次对这些家庭的家庭成员和家庭空间进行微生物采样。他们采集了脚、手以及鼻子等身体部位,还从不同房屋的门把手、地板、开关和厨房柜台等地方采集了微生物样本。

接着,通过扩增以及基因测试,吉尔伯特的团队分离出了超过两万种微生物物种。每个家庭的微生物物种都不尽相同,也就是说,不同的家庭可以用各自不同的微生物“签名”来互相识别区分。结果发现,对于那些搬入新家的家庭,这些“签名”微生物迅速地转移到了新的家庭生活空间里,而且铺天盖地地取代了房间原有的微生物种类。根据吉尔伯特的研究,这些“殖民者”只需3小时就可以覆盖到每个房间里,24小时就能完全取代之前房间内的微生物。

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不同身体部位(手、脚、鼻子等)与房间区域(门把手、厨房、地板等)的“微生物交叉度”。OTU:operational taxonomic unit,操作分类单元。方块颜色越偏红、OTU值越大,则两者之间的微生物群落越为相似,微生物转移越频繁,反之亦然。看来就OTU而言,卧室地板和厨房地板差不多嘛。图片来源:研究论文

不出所料,最常发生微生物转移的地方是手和门把手以及地板与脚之间。不同的家庭之间,微生物差异最大的地方是地板。在家庭内部,父母与年幼的孩子,以及夫妻之间微生物的差异则是比较小的。而青少年们,由于经常有自己独立的空间和生活,和父母的微生物菌群差异比较大。对于年幼的孩子和肠道菌群被抗生素破坏的人群,他们更容易“接受”别人的微生物菌群。吉尔伯特正在说服他的妻子买条狗,因为家庭宠物如果清洁得当,则常常会是“优秀微生物”的提供者。这能够增加家庭微生物群落的多元化,并且被证明能够减少脆弱性过敏。

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那么它们能做些什么?

吉尔伯特说道,由于不同的家庭有不同的微生物“签名”,研究人员能够用微生物来绘制家庭周围这些家庭成员的运动轨迹,并由此“监控”成员之间的相互作用。“我们能够知道,有多少人生活在房子里,以及这些人的关系是什么。”吉尔伯特如是说。

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不同的七个家庭间的微生物“签名”不尽相同。图片来源:研究论文

他讲述了一个案例:其中的一对夫妇把房间出租给了一个男房客。研究人员通过分析微生物“签名”得出,两个男人使用一间卫生间,而女性则使用另一间——这一结果得到了这对夫妇和男房客的证实。吉尔伯特表示,从理论上来说,这项研究能监测到一对新的感情,或者指示婚外恋。而如果建立一个史无前例额的微生物“签名”数据库,那么犯罪现场遗留的微生物“指纹”也许能够用来识别犯罪。

在短期内,这项工作结果能够用来识别屋里是否进过小偷,或者通过皮肤微生物对比识别一桩犯罪案件的凶手与受害人。据此,吉尔伯特和他的团队正在和美国警方展开合作。(编辑:Jerrusalem

重症监护室(ICU)中地板,医疗设备及工作间表面样品

参考文献:

  1. S. Lax et al.(2014) Longitudinal analysis of microbial interaction between humans and the indoor environment 

高通量测序:环境微生物群落多样性分析

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柱状图(图5)
横轴:各样品的编号。
纵轴:相对丰度比例。
图标解读:
Ø 颜色对应此分类学水平下各物种名称,不同色块宽度表示不同物种相对丰度比例;
Ø 可以在不同分类学水平下作图分析。
饼状图(图6)
在某一分类学水平上,不同菌群所占的相对丰度比例。不同颜色代表不同的物种。
5. 样品OTU 分布Venn 图
用于统计多个样品中共有或独有的OTU数目,可以比较直观地表现各环境样品之间的OTU 组成相似程度。
不同样品用不同颜色标记,各个数字代表了某个样品独有或几种样品共有的OTU 数量,对应的OTU编号会以EXCEL 表的形式在结题报告中呈现。

高通量测序:环境微生物群落多样性分析

图例解读:
Ø 图15中体现的是序列进化差异情况,处在同一分支上的物种说明进化关系较近。
Ø 图15左下角的图例为距离标尺,分支距离越长,进化关系越远。
11. (un)Weighted UniFrac PCoA/Tree 分析
利用各样品序列间的进化信息来计算样品间距离,反映环境样品在进化树中是否有显著的微生物群落差异。
PCoA(principal co-ordinates analysis)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法,通过一系列的特征值和特征向量进行排序后,选择主要排在前几位的特征值,PCoA 可以找到 距离矩阵中最主要的坐标,结果是数据矩阵的一个旋转,它没有改变样品点之间的相互位置关系,只是改变了坐标系统。通过PCoA 可以观察个体或群体间的差异。

分析要求
单张分析图,样本分组至少两个,最多5 个。
Ø 默认设置为97% 相似度水平下以OTU 为单位进行分析作图。
6. Heatmap 图
用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息,它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。将高丰度和低丰度的物种分块聚集,通过颜色梯度及相似程度来反映多个样品在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。

高变区

测序量(reads)

测序量(reads)

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Roche GS

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高变区

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测序平台

16S rRNA

MiSeq

测序平台

70,495

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相对丰度比例:
热图(图8)中每小格代表其所在样品中某个OTU 的相对丰度。以图8为例,红框高亮的小格所对应的信息为:样本(R11-1Z)中OTU(OTU128)的相对丰度比例大概为0.2%。
丰度比例计算公式(Bray Curtis 算法):

测序量(reads)

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第二代高通量测序技术

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图例解读:
Ø 图22构建了地下植物与真菌的相互关系网络;
Ø 图22中灰色圆点表示与植物共生的微生物物种,菱形代表真菌OTU,它们之间的关系用灰色连接线表示;
Ø 它们之间的密集程度越高表示它们之间相互作用被观察的次数越多;
Ø 互利共生真菌OTU 用粉色菱形表示;寄生微生物OTU用橘色菱形表示;未知功能OTU用蓝色菱形表示;
Ø A:子囊真菌门;B:担子菌门;G:球囊菌门;U:表示门水平未知真菌。
案例描述二
The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing. Sci Rep. 2013;3:1413.
室内微生物群落对日常生活中人类健康起着重要作用,尤其是医院的重症监护室。采用扩增焦磷酸测序研究ICU 中微生物群落可以检测多种微生物序列,与现有的传统标准培养技术相比,有极大的优越性。
传统培养方式只能检测总细菌多样性的2.5%。结合外部环境与物种系统发育谱分析发现,许多微生物与潜在的人类病原菌相关,当然也包含有益菌,一共7 个门76 个属。此外,丙酸杆菌属,假单孢菌属和伯克霍尔德氏菌被确定为感染的重要来源。在地板,医疗器械和工作间微生物组成有显著差异,但网络分析和一致性分子指纹印记分析发现该三个地点微生物组成也有一定的相似性。这些信息将帮助加护病房进行新的公共卫生风险评估,帮助建立新的卫生协议,帮助深入了解医院获得性感染的情况。

横轴:从某个样品中随机抽取的测序条数;"Label 0.03" 表示该分析是基于OTU 序列差异水平在0.03,即相似度为97% 的水平上进行运算的,客户可以选取其他不同的相似度水平。
纵轴:基于该测序条数能构建的OTU数量。
曲线解读:
Ø 图1中每条曲线代表一个样品,用不同颜色标记;
Ø 随测序深度增加,被发现OTU 的数量增加。当曲线趋于平缓时表示此时的测序数据量较为合理。
2. Shannon-Wiener 曲线
反映样品中微生物多样性的指数,利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线,以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。
当曲线趋向平坦时,说明测序数据量足够大,可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

植物根系/ 泥土

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样本来源

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样本数量

图例解读:
Ø 图20横坐标为两组样品;
Ø 纵轴坐标为unifrac 进化距离(序列差异)。
15. 单因素unweighted unifrac PCA 分析
在某单一因素上,进行unweighted unifrac PCA 分析。

高通量测序:环境微生物群落多样性分析

图例解读:
Ø 图18中不同的颜色代表不同的分组;
Ø 建议不分组时,样本数量不少于10个;多组样本时,每组样本数量不少于5个;
Ø 图18中的点代表样本,点与点之间的距离表示差异程度。
13. 含相似性树柱状图
11664858.com,根据样品中相似程度进行排布,并绘制对应样本树状图反映样本中群落结构。

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单样品图(图12):可以了解单样品中的序列在各个分类学水平上的分布情况。

图例解读:
Ø 图16和图17中不同颜色代表不同分组;
Ø PCoA 分析建议不分组时,样本数量不少于10 个;多组样本时,每组样本数量不少于5 个;
Ø 对于某一功能基因,进行进化树分析时,建议采用OTU数目控制在10,000以内,或者由客户指定分析优势OTU个数。
12. NMDS 分析
NMDS(Nonmetric Multidimensional Scaling)常用于比对样本组之间的差异,可以基于进化关系或数量距离矩阵。
横轴和纵轴:表示基于进化或者数量距离矩阵的数值在二维表中成图。

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图24 为免疫缺陷疾病各亚型患者皮肤和口腔微生物群落结构的协方差。(a)图表示35个皮肤样本的微生物多样性的差异;(b)图表示21个口腔样本微生物多样性差异。其中,绿色方块表示健康对照组,红色圆圈表示CMC,蓝色三角形表示HIES。健康人体皮肤表面的微生物主要包括葡萄球菌和棒状杆菌,而疾病组多为莫拉菌科。

测序平台

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